制備微生物檢測培養(yǎng)基細節(jié)問題

一、稱取

用度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品。先根據(jù)配方計算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量，然后用天平準確稱取。稱量時用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。稱量紙折疊方法如圖所示。

二、溶化

培養(yǎng)基放入燒杯或搪瓷缸中，慢慢加入少量所需水，邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂，培養(yǎng)基不需要加熱；如果含有瓊脂，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸，*溶解后，再補齊所需水，并攪拌均勻（如圖3所示）。如果配制的培養(yǎng)基量很大，可用不銹鋼鍋加熱溶化，可先用溫水加熱并隨時攪動，防止焦化，如有焦化現(xiàn)象，配制的培養(yǎng)基就不能使用，要重新配制。

配制培養(yǎng)基時不可用銅或鐵的容器溶化，因銅或鐵制容器可能會使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量超標，影響實驗（培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L，細菌不宜生長，鐵含量超過0.14mg/L，妨礙細菌產(chǎn)毒素）。對容易發(fā)生反應，產(chǎn)生沉淀的藥品，要分開溶解，后加入培養(yǎng)基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。

三、調(diào)pH

雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分，能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi)，但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求，就要進行必要的調(diào)整。如果有已校準pH計，可用pH計，如果沒有，可用精密的pH試紙，再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸（微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸）調(diào)制所需的pH。培基的pH一般為7.4～7.6，也有酸性或堿性的。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基，在調(diào)整pH時要調(diào)至高出所需0.1個～0.2個單位，因用氫氧化鈉調(diào)整時，高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分，可不pH。

四、過濾

配成的培養(yǎng)基，若無特殊要求，可省略此步。若有沉淀或渾濁．需要澄清的．液體培養(yǎng)基可用油紙過濾。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾。如果過濾法還不能達到澄清的要求，則可用蛋清澄清法，即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃，裝入三角瓶內(nèi)（不超過容量的二分之一），按1000mL加人1個～2個雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min，高壓蒸汽滅菌121℃、20min，取出趁熱過濾即可。

五、分裝

配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中，分裝試管，如果試管量很大，可用自動分液器，如果試管量少，可用漏斗分裝。分裝量不超過容器容積的三分之二。三角瓶以不超過容積的二分之一為宜；瓊脂斜面以不超過試管長度的五分之一為宜，滅菌后，擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一，底層為三分之二的量為宜；半固體瓊脂分裝量為試管長度的三分之一；用來接種或保菌的高層瓊脂，分裝量為試管長度的四分之一或三分之一，用來接種厭氧菌的要達到三分之二；瓊脂平板，內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜，內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多，可將平板倒扣，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min，干燥后再用。每批培養(yǎng)基應另外分裝一小玻璃瓶（約20mL）與該批培養(yǎng)基同時滅菌，為測定該批培養(yǎng)基終pH。

六、滅菌

分裝好的培養(yǎng)基應立即進行滅菌。滅菌的方法種類如下：

1.       高壓蒸汽滅菌法

大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法，小量分裝時，用121℃，15min；滅菌量大時，用121℃，30min滅菌；含糖類的培養(yǎng)基只能113~115℃，15min滅菌，避免糖類遭破壞。

2.煮沸滅菌法

對含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基，可使用此方法。

3.過濾除菌

以過濾的方法除菌，用無菌操作技術，定量加入培養(yǎng)基。血液、抗生素可用無菌操作技術抽取，加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時，可用此法。

對LST培養(yǎng)基進行滅菌時，有時發(fā)酵管內(nèi)會有氣泡。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，可以采取以下幾項措施：

1. 小倒管浸滿培養(yǎng)基（不留氣泡）后再加入到盛LST的試管中。

2.滅菌鍋關閉放氣閥前，將鍋內(nèi)氣體排干凈。

3.試管塞不要塞得太緊（使用硅膠塞的時候），勿使用橡皮塞。

4不要過早打開滅菌鍋，要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋。

如果以上情況都做到還有氣泡，可用水做培養(yǎng)基組的對照試驗，若培養(yǎng)基組有氣泡，而對照組沒有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因。

七、倒平板

滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后，倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基的溫度不能過高，否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水；溫度太低，培養(yǎng)基又容易凝固成塊，無法制成平板。倒平板時，應在靠近酒精燈火焰進行，以免外界的雜菌落入平板內(nèi)，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開一條縫，至瓶口剛好伸入，倒入培養(yǎng)基，以鋪滿底為限，不超過培養(yǎng)皿高度的三分之一，迅速蓋好蓋，放在桌面上，輕輕地轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基分布均勻，冷凝后即可。

八、擺斜面

裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒（或玻璃棒）上，并成適當?shù)男倍龋鋮s后，瓊脂凝固即成斜面。斜面長度不用超過試管二分之一。

九、質(zhì)量檢查

培養(yǎng)基滅菌后仔細檢查一遍，發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染，都要丟棄，不能再用。并測定其終pH。還需進行無菌檢查和效果檢查。無菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管（瓶）~2管（瓶），37℃恒溫培養(yǎng)1d～2d，確定無雜菌生長；效果檢查是用標準菌株接種在相關的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長、形態(tài)及生化情況，與已知情況相符。兩種情況都合格，配制的培養(yǎng)基方可使用。